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                        國家一級期刊

                        國際刊號:  國內刊號:41-1434/TS  郵發代號:35-53
                        現代食品

                        期刊名稱:現代食品
                        英文名稱:Modern Food

                        主管單位:中糧工程科技有限公司
                        主辦單位:鄭州中糧科研設計院有限公司
                        編輯出版:現代食品雜志社

                        主  編:陳華定
                        社  長:吳祖風
                        責任編輯:吳祖風(兼)高惠文
                        英文審校:吳祖風
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                        國際刊號:ISSN 2096-5060
                        國內刊號:CN 41-1434/TS
                        郵發代號:36-53
                        發行范圍:國內外統一發行
                        廣告許可:鄭惠濟市監廣發登字(2019)001號
                        社  址:河南省鄭州市南陽路153號
                        首頁 > 采用多菌種釀造醬油技術及應用于工業生產的研究進展

                        采用多菌種釀造醬油技術及應用于工業生產的研究進展

                        2018-07-27 10:17:25     字體:   打印 收藏


                        摘 要:醬油是我們平時生活中缺一不可的調味劑,它不僅有調味作用,還有一定的營養保健作用,本文敘述了闡明醬油釀造工業的不同、以及多菌種制曲與多菌種發酵中的菌種種類及其在醬油中的作用的研究進展,對多菌種釀造醬油技術進行補充,以期為醬油生產提供釀造提供技術支持基礎

                        關鍵詞:多菌種;高鹽稀態醬油;低鹽固態醬油;工業生產

                         醬油也叫鼓油,是利用大豆、小麥等原材料,然后經過制曲、發酵等過程釀造出來的調劑品。最開始,醬油是從“醬”演變而來的,而醬油的釀造也是偶然間發現的,來自源于中國古代皇帝御用的調味品。醬油最開始是用鮮肉腌制而得到的成,和與現在生產魚露的過程相同,。然后之后,由于其風味絕佳慢慢地在民間興盛起來,逐漸漸漸地,人們發現其與大豆制成的風味相近,而且用大豆釀制價格便宜,所以被廣泛食用該方法便廣泛流行。醬油對菜肴的味道以及色澤有著積極影響。微生物在醬油釀造的過程中發揮著作用,分泌的酶具有催化作用,然后參與到復雜的生化反應中。在醬油的發酵過程中,其重要次生菌群對醬油風味的形成有非常大的影響。其中,制曲是醬油發酵非常關鍵的環節,制曲的本質就是根據微生物在釀造原料上繁殖生長的作用,然后生成許多的淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶等酶類[1],它們會在發酵期發揮作用。

                          1 高鹽稀態和低鹽固態醬油釀造工藝及其區別

                          高鹽稀態和低鹽固態是醬油的生產工藝兩種主要的醬油生產兩種發酵方式。根據研究發現,因為高鹽稀態發酵醬油在發酵過程中,,其酵母菌(microzyme)及乳酸菌((lactobacillus))等次生菌群較多,因為其發酵周期長,對醬油風味的形成有著積極影響,可使醬油的香味濃郁、感官品質好,但是發酵周期長,會導致高鹽稀態醬油的產量偏低,工業生產的規模較小;低鹽固態發酵主要以米曲霉為主,與高鹽稀態發酵相反,其周期短,可是但是對醬油風味的形成有積極作用的次生菌群較少,因此所釀造出來的醬油風味及感官品質較差。

                          其中低鹽固態法是目前我國醬油行業普遍采用的釀造工藝,產量占到我國醬油年產量的90%,但是這種方法不能有效地利用其蛋白質原料,。根據查閱相關文獻,中國在低鹽固態醬油中對全氮利用率僅僅僅為66%左右,而日本對全氮的利用率最高可達到在92%以上。

                          1.1 醬油中乳酸菌種的分布及其作用

                          乳酸菌在醬油的制曲和發酵中發揮的作用不可忽視,是醬油醬醅中的主要細菌,是一種耐鹽的菌種。首先,①乳酸菌在酒醅中的繁殖生長減小了醬醅的pH值,因此控制了雜菌的生長,促進了能生成醬油風味的菌種的生長,如,球擬酵母和魯氏酵母等。,從而間接地促進了醬油風味的提升;另一方面,。②乳酸乙酯能使醬油具有良好的香味,而乳酸菌代謝會產生乳酸,酵母菌代謝生成的乙醇會與乳酸經過反應生成乳酸乙酯[2];而且,。③醬油的咸味會因為乳酸的作用而被隱藏,使醬油味道變得純正濃厚。相關的研究[3]表明,將乳酸菌加在醬油發酵的過程中,可使醬油的色澤有所提高強化,醬油的紅亮度有所增強提高。

                          根據相關的實驗,可以從高鹽稀態醬油的醬醅樣品中發現,中后期和中下層的乳酸菌稍微多點。而低鹽固態醬油在發酵初期,乳酸菌主要分布在醬醅上層,而在中、下層的分布逐漸減少;在發酵中期,中、下層的乳酸菌比較多;在發酵末期,每層的乳酸菌數目達到一個平衡。

                          1.2 醬油中酵母菌種的分布及其作用

                          查閱相關文獻知道可知,在醬油進行發酵的時候,酵母不僅可以產生各種醇類物質,還可以在代謝過程中生成4--羥基--2--乙基--5--甲基--3--呋喃酮、4--羥基--2,5二甲基--32--呋喃酮和4-Ethylphenol[4-5]等物質,因為它們的存在形成了不同的醬油風味,其中醬香的主體香主要是來源于4-Ethylphenol。

                          根據實驗研究發現,在高鹽稀態醬醅中,酵母菌在中層的數量一直比表層多,在發酵前期的數量比后期低很多。而在數量和比例上,酵母菌在低鹽固態醬醅中和高鹽稀態醬醅中有非常大的區別。此外,在低鹽固態發酵中,伴隨著上層醬醅中鹽分的溶解滲透,其下層醬醅中的鹽含量會隨時間增大,而酵母的數量卻會隨時間減少;。通過實驗發現,在低鹽固態發酵中,由于大多數進行有氧呼吸的酵母的耐鹽性較差,在上層醬醅分布較廣;反而在高鹽稀態發酵中,酵母菌耐鹽性好,因此在醬醅中層分布較廣,以便進行無氧呼吸,對厭氧發酵有促進作用從而,有益于形成醬油中的風味物質。由于對形成醬油風味物質息息相關的酵母大多數是耐鹽性酵母,所以,根據酵母菌的分布情況、數目、耐鹽性等可以發現,酵母菌群在低鹽固態發酵中對醬油風味形成發揮的作用沒有在高鹽稀態發酵中的作用好。

                          1.3 醬油中的微生物類群

                          有研究發現,酵母菌以及乳酸菌在高鹽稀態醬油中的種類要比低鹽固態醬油中的要多點,。在實驗中,高鹽稀態醬油分離出5種酵母菌,而低鹽固態醬油中分離出3種,初步鑒定出,其分屬為球擬酵母屬(torulopsis spp)、假絲酵母屬(candida spp)、酵母菌屬(saccharomyces spp)、畢赤酵母屬(picia spp)。同時,乳酸菌在高鹽稀態醬油中的種類也高于低鹽固態醬油,。在高鹽稀態發酵中,實驗分離出了6種乳酸菌,而在低鹽固態中僅僅分離出4種乳酸菌,初步判斷為乳桿菌屬(lactobacillus spp})、片球菌屬(pediococcus spp)、鏈球菌屬(streptocccus spp)、芽孢桿菌屬(bacillus spp)。但不同的是,分離出的霉菌在低鹽固態醬油中比高鹽稀態醬油中種類的多很多。根據相關的實驗數據,在數量上,高鹽稀態發酵中的米曲霉(aspergillusoryzae)有很大的優勢,可是但是霉菌的種類在低鹽固態醬油中有很大的優勢,不過其中可能有對醬油發酵和風味物質有不利影響的霉菌。

                          2 多菌種釀造醬油技術

                          醬油是通過微生物進行發酵從而對淀粉質原料和蛋白質原料進行利用而制成的調劑品。淀粉質原料在發酵中能生成糖和有機酸、,并且有機酸能與醇發生作用生成酯等,蛋白質原料被蛋白酶水解,產生氨基酸及胨、肽等營養物質,而這些生物化學變化過程都必須要有微生物的發酵和微生物生成的酶來進行。蛋白質原料和淀粉質原料在發酵中的轉化都極其關鍵,它們所要利用的多種酶都是從不同種類的微生物中得到。根據我國在釀造醬油中利用微生物的發展情況中可以看出::單菌種制曲有其特點,能彌補天然制曲生產中質量不穩定、酶活力小等缺陷,可是但在醬油風味方面,它這種方式釀造出來的并沒有多菌種發酵和天然發酵的效果好。事實上,多酶系對生產好醬油有很大的關系,而多菌種制曲能生成多酶系,因此多菌種發酵對醬油釀造至關重要。。在現在目前的條件下,多種酶系不可能僅僅來自一種或著少數菌種,而是從多菌種中產生[6]。利用多菌種發酵,原料的利用率會大大提高、加工周期也能大大縮短,從而提高了生產效率。

                          2.1 多菌種制曲

                          多菌種制曲,是指以米曲霉為主,添加其他菌種協同發酵制曲;旌暇N制曲的主要目的是提高原料利用率和醬油成品香氣、色澤等質量標準[7]。2種及以上菌種制曲的原理:醬油進行發酵時,酸性蛋白酶要在偏酸性條件下才能更好地反應。黑曲霉代謝酸性蛋白酶能力較強,在酸性環境下,可以補償米曲霉分泌的堿性蛋白酶失活的作用不足。黑曲霉所產的酶類較多,因此黑曲霉在釀造過程中生成的風味成分也比較多,并且對原料蛋白質的分解有促進作用。紅曲霉對醬油的色澤有積極作用,可使醬油色澤明艷、氣味清香。加入其他菌種的目的是為了得到更多的酶類,加快原料中蛋白質和淀粉的分解速度,促進風味物質的生成,提高醬油的感官品質。[8]

                          有研究發現,采用雙菌制曲時,米曲霉含量高于95%時會強烈抑制黑曲霉;戴德慧等[9]研究發現,接種量對糖化酶和蛋白酶活力有很大的影響。因此,為了獲得更好的協同作用、減少競爭性抑制對各種酶活力的影響,多采用分開制種曲、混合制大曲或者分開制曲、混合發酵的工藝。也有研究采用激活性營養因子解決混菌發酵中多菌株生長不同步的問題。武金霞等用米曲霉的激活性營養因子制成了激活劑,可激發并加速米曲霉的萌發,在雙菌種混合制曲時,能使米曲霉和黑曲霉的孢子萌發率更為一致[10]。

                          2.1.1 米曲霉

                          米曲霉(Aspergillus oryzae)屬于曲霉屬菌種,在初期其菌落的顏色多數為黃色或者白色,成熟后為淺綠色和黃綠色。溫度在30 ℃左右時,米曲霉生長最快,而低于28 ℃時,其菌體生長慢,高于37 ℃時,會對菌體的代謝和酶的分泌造成負面影響。醬油釀造過程中主要是通過米曲霉代謝分泌出的各種酶的作用進行發酵,。在釀造行業,,米曲霉是人們研究的得最多的菌株之一。米曲霉是被美國公布的一株安全微生物生產菌株之一。

                          米曲霉3.042菌株,最初是由上海市釀造科學研究所W中科AS3.863為原始菌株,經紫外誘變W及后期的長期馴化得到的優良菌株。米曲霉3.042菌株能生成蛋白酶 、淀粉酶等,具有較強的酶活力,常常被應用于醬油釀造中。其蛋白酶系中的堿性蛋白酶和中性蛋白酶活性較高,但是酸性蛋白酶活性不高。各地以米曲霉3.042為出發菌株,采取各種形式進行誘變篩選得到了多種各具特色的菌株 ,如天津誘變出的"“米曲霉10B1”",廣州誘變出了"“米曲霉-廣州”,,,傅力等[11]通過紫外線和LiCl復合誘變獲1株蛋白酶高產菌株,與出發菌相比,蛋白酶活力提高了33.3%,%,而且遺傳穩定性良好。

                          與米曲霉混合發酵的菌株大多都具有如下特征:糖化酶活力較高,能和米曲霉酶系互補;能生成許多纖維素酶,然后破壞原料的細胞壁,利用其中的蛋白質與淀粉等原料;產酯化酶,豐富產品的香氣;產紅色素,增加增強醬油色澤。常用的混合制曲菌種包括:能產纖維素酶和酯化酶的根霉和木霉;能產許多淀粉酶和纖維素酶等酶的黑曲霉;能產糖化酶、酯化酶和紅色素的紅曲霉;產纖維素酶的粗壯脈紋胞菌等混合菌種制曲中,由于多種菌種之間存在拮抗作用,需嚴格控制接種量和菌株配比。

                          2.1.2 紅曲霉

                          紅曲霉(Monascus sp.)最適生長溫度為 32-~35 ℃,最適 pH 為 4.5 左右,紅曲酶菌落不同就有不同的顏色,主要有淡紅色、紅色等,同時紅曲霉對發酵底物的選擇能力很強,多種碳源和氮源可以被紅曲霉利用[12]。紅曲霉是一種耐酸、耐高溫的菌種,它糖化和酯化的能力良好,。在釀造行業方面,紅曲霉制成的糖化增香曲已有一定的應用,在一千年前1 000年前,中國就開始有相關的紅曲霉應用,其中黑色素是紅曲霉的衍生物,屬于天然色素,紅色素能夠使 pH、溫度和氧化還原劑等穩定[13],洛伐他丁能由紅曲霉生成,由于它的其降脂能力好,因此在醫學保健領域有很多相關的研究。姚繼承[14]等在醬油釀造的過程中添加糖化增香曲,發現采用紅曲霉混合制曲會使醬油再中的總氮及氨基酸態氮含量升高,增強醬油色澤、香味、口感等,紅曲色素和洛伐他丁汀是其主要的代謝產物。其中,紅曲色素是一種天然的功能性色素,可作為添加劑,應用到食品行業中;洛伐他丁汀能夠抑制膽固醇的合成,因此可以作為一種有效的降脂藥物。

                          紅曲霉在 PDA 培養基上的菌落初始呈白色,毛毯狀,具褶皺,成熟后菌落呈紅色,菌落背面呈紅紫色,且培養基被染成紅色。 Ainsworth 分類系統將紅曲霉屬歸于真菌界(eumycetesThe Fungi),真菌門(Eu-mycota),子囊菌亞門(Ascomycotina),不整囊菌綱(Plectomyhcetes),散囊菌目(Eurotiales), 紅曲科(Monascaceae),紅曲霉屬(MonascuspurpureusWentMonascus)。其中,有8種重要的紅曲霉被相關的研究所正式收集編目。

                          2.1.3 黑曲霉

                          黑曲霉(Aspergillus niger)也是曲霉屬中一種重要的微生物菌株,最適生長溫度 37 ℃,最適 pH 5.0-~6.0,屬于好氧的菌種,在食品、醫藥、發酵等行業已經被廣泛應用[15]。黑曲霉產酸性蛋白酶強的能力很強,在醬油發酵中后期,酸性蛋白酶可以大大提高蛋白質的利用率,提高氨基酸態氮的生成率,同時具有一定的產糖化酶、淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、脂肪酶以及葡萄糖氧化酶等能力,因此在醬油制曲研究中,黑曲霉被越來越多地應用。

                          Viki[16]等在實驗中發現,,采用黑曲霉和米曲霉混合發酵,,能讓原料中的谷氨酞胺酶的含量提高1倍,,以此使發酵產品中的谷氨酸含量增高,其含量能增加15%左右。Ishiharn[17]等在實驗中發現,,采用米曲霉和黑曲霉混合制曲,,能提高醬油發酵產物中的主要形成香味物質的含量,如,4一-羥基一-2一-乙基一-5一-甲基一-3一-吠喃酮等。

                          2.1.4 米根霉

                          根霉是屬于藻狀菌門毛霉科的一類菌,,它也是我國在釀造行業中常用的一種霉菌,,通常使用是米根霉。米根霉在固態發酵過程中可以分泌出豐富的酶系,,如淀粉酶、糖化酶、脂肪酶等等。另外,,米根霉還能夠產生乳酸、檸檬酸以及唬泊酸等有機酸類物質。用米根霉同米曲霉和黑曲霉混合制曲,,在醬油發酵過程中有利于促進糖類物質的形成,,增加醬油中的風味物質以及提高原料蛋白質的轉化率,,提高了醬油的質量,,另外還可以在一定程度上增加增強醬油的色澤。

                          2.2 多菌種發酵

                          多菌種發酵,一般是指在發酵過程中加入酵母菌和乳酸菌,其中乳酸菌可以使有害微生物的生長受到抑制并產生酯類的前體物,,酵母菌會生成許多乙醇和相應的有機酸和酯類 ,,然后能改善產品的感官品質。

                          多菌種發酵的概念的最早是日本在20世紀 80年代提出來的,有研究發現,在發酵期間加入乳酸菌、魯氏酵母菌、球擬酵母菌,明顯能明顯提高醬油的風味,并且研究了各類菌所產物質,研究了醬油成分變化。SUGIYAMA S等[18]對醬油菌種進行了相關的研究,發現Saccharomyces sojae在發酵過程中能生成醇類和醛類等香氣以及呈味的琥珀酸等。Candida versatilis發酵過程中能產生極少的4_-乙基愈創木酚等物質。耐鹽性乳酸菌主要為嗜鹽片球菌(Pediococcus halophilus)和四聯球菌(Tetracoccus sojae),在30 ℃的條件下產生的乳酸是醬油風味中主要有機酸的主要來源。雖然乳酸菌、酵母菌能夠共同生長,可是但是若乳酸菌的生長太早,繁殖太旺盛,則會對中性蛋白酶的分解產生消極影響,最終造成醬油的總酸偏大。

                          2.3 多菌種釀造醬油的優點

                          其一,2.3.1 利用原料的全氮能力強。

                          采用混合菌種技術釀造出來的醬油,,其醬油的原料全氮利用率明顯比單一菌種發酵的醬油高。張國春[19]采用滬釀3.042米曲霉單菌種釀造醬油,,全氮利用率在72%左右。而將米曲霉和甘薯曲霉等菌種混合發酵,,釀造出來的醬油的全氮利用率能增加4%左右。

                          其二,2.3.2 氨基酸生產率高。

                          判斷醬油質量高低的重要指標之一就是氨基酸的生產率,張國春[19]在低鹽固態法發酵醬油中,,采用多菌種釀制的氨基酸生產率大概在50.5%左右,,比采用米曲霉單菌種釀造的醬油提高了3%左右。

                          其三,2.3.3 混合培養容易控制。

                          混合菌種的繁殖生長快,,菌種生成的物質之間可以互相補充,,而且可以防止雜菌污染,,故其與單一菌種相比,其發酵條件更容易控制。比如,在醬油發酵過程中,,淀粉被米曲霉分泌的淀粉分解酶水解得到葡萄糖,,然后在第二階段發酵中,葡萄糖被酵母和細菌利用。在這樣的混合培養條件下,,尤其是有許多培養物共同生長繁殖,,其被污染的可能性極小,,就算發生了污染,,影響也不大。在混合培養中,微生物區系多數情況下都有很大的優勢,,乃至培養基可以不消毒。

                          另外,翟瑋瑋[20]在研究醬油發酵中發現,把根酶、米曲霉、黑曲霉單獨制曲后混合發酵,其蛋白酶活力和原料利用率都大大地增大,醬油中總氮和氨基酸態氮的含量有所提高。在釀造成熟期加入乳酸菌和酵母菌,能使醬油的風味有所提高。Plaude等[21]用Streptococcusthermophilus、Lactobacillus helvet和Bifidobacteriumlongum三 3種益生菌純種接種、混合接種生產醬油,與對照組相比,醬油中大豆異黃酮和B族維生素含量都有所上升。

                          3 釀造醬油技術并運用于在工業生產中的應用

                          現在,醬油產品的生產技術不再是原來的天然曬露發酵,已發展成現代工業化生產,同時也不只是不再是單一菌種發酵,還而是采用混合菌種技術釀造,醬油的釀造工藝也有相應的變化。國內許多學者針對醬油產品生產技術方面的發展情況做了相關的總結,并發表了大量與之相關的文獻。王夫杰對多酶共同發酵、多菌種共生的這一方面,發表了“《我國醬油研究現狀與發展趨勢》”一文,對研究醬油風味物質在釀造過程中的形成情況進行了綜述,還闡明了將來的研究方向;而成都市調味品研究所的李幼筠從微生物在醬油釀造過程中共同有效利用的角度,發表了《科學利用微生物推動中國醬油工藝大變革》一文。進行了相關的說明, 提出了高鹽稀態冷溫型的釀造工藝。

                          3.1 二次加工,開發醬油新產品

                          近幾年來,將醬油產品進行二次加工在醬油生產行業慢慢地發展起來。在釀造過程中加入合適、適量的食品添加劑來提高增強醬油產品的色澤、增添其香味; ;重新對營養組成進行調整,改善產品的感官品質,使醬油的品種變多。例如,用琥珀酸二鈉配制的蒸魚醬油,將鹽、黃砂糖等調味料加入普通釀造醬油加工工藝中得到的醬油膏等,增加了我們對醬油口味的選擇,使調味品變得豐富起來。有了經濟的發展和技術的創新的帶動,我們可以相信,二次加工產品將打破醬油終端產品的尷尬場面,讓產品多樣化。

                          3.2 生產好醬油產品的趨勢更加優質的醬油

                          多菌種釀造醬油為提高產品質量和原料出品率提供了條件, ,為釀造行業加入了新鮮的技術。很多國內外學者為了改善醬油風味,做了很多與之相關的實驗研究,F在的相關技術,除了采用多菌種發酵法,還有幾種現代化技術,例如,固定化細胞技術、膜分離技術、微生物調控技術等,但在實際的生產中應用并不多,大多數采用多菌種發酵法。日本曾想在醬油發酵期間加入相關的酶來改善醬油風味, 如,KIJIMA K等[22]在實驗中,將能產γ-谷氨酰胺轉肽酶的細菌加在醬醅中來增強醬油的味道。γ-GGT 作為催化劑,使γ-谷氨;衔锼鉃榘被岷投嚯。GGT能將Gln轉化為為Glu,也就是所謂的谷氨酰胺酶反應。從醬油中可以分離出一種菌種,它可以生成 GGT,然后將其和已失去轉肽作用的變異GGT,加到醬醅中進行發酵,然后從所得到的產品中測得相關數據發現,發現其谷氨酸含量提高了35%左右,其風味也有所改善。對于關于醬油生產中酶制劑的運用,我國進行了深刻的入研究。例如,施安輝等[23]在釀造原料蒸煮冷卻后加入相關的新型復合酶,使釀造醬油的生產成本和勞動強度大大地減少了小。

                          4 結語

                          采用多菌種釀造技術釀造醬油,在不影響醬油本身的感官品質的前提下,根據菌的種類和添加量的不同,其總氮、氨基酸態氮、谷氨酸等物質的含量都會有所增加,。從中可以發現,把米曲霉、黑曲霉、紅曲霉等菌種在制曲時加入其中,不但可以讓醬油中的總氮和氨基酸態氮含量增加,還能提高原料利用率,對醬油風味也有一定的改善。采用多菌種制曲可以降低廠家的生成生產成本,提高其經濟效益,并且多菌種發酵也能擺脫單一菌種釀造醬油的單一風味,豐富醬油的風味,是一個生產高產量、高品質醬油的前進方向?梢,多菌種釀造醬油技術是未來醬油行業發展方向之一,。隨著釀造技術的現代化技術應用越來越多,我們應在進一步發揚光大傳統釀造優勢的同時,也應該利用現代化新技術克服發酵過程中所出現的不足。

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