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                        國家一級期刊

                        國際刊號:  國內刊號:41-1434/TS  郵發代號:35-53
                        現代食品

                        期刊名稱:現代食品
                        英文名稱:Modern Food

                        主管單位:中糧工程科技有限公司
                        主辦單位:鄭州中糧科研設計院有限公司
                        編輯出版:現代食品雜志社

                        主  編:陳華定
                        社  長:吳祖風
                        責任編輯:吳祖風(兼)高惠文
                        英文審校:吳祖風
                        編  輯:李 琦

                        電  話:0371-56092565
                             0371-63731409
                        編輯QQ:2836192365
                             3298264075
                             2740137648
                             1252528457
                        郵  箱:xdspbjb@163.com

                        國際刊號:ISSN 2096-5060
                        國內刊號:CN 41-1434/TS
                        郵發代號:36-53
                        發行范圍:國內外統一發行
                        廣告許可:鄭惠濟市監廣發登字(2019)001號
                        社  址:河南省鄭州市南陽路153號
                        首頁 > 海洋放線菌酰胺酶AM合成基因的克隆

                        海洋放線菌酰胺酶AM合成基因的克隆

                        2018-07-27 13:58:00     字體:   打印 收藏


                        摘 要:克隆稀有海洋放線菌酰胺酶AM合成基因的基因片段。根據Salinispora arenicola CNS-205的核苷酸序列保守區設計兩對酰胺酶特異性引物,以其總DNA為模板,采用PCR的方法擴增得到了包含酰胺酶AM的完整的基因片段,并將該片段成功插入到克隆載體pUC-18中。將重組質粒進行酶切驗證,并在檢測機構中驗證測序結果正確。,成功地獲得了稀有海洋放線菌Salinispora arenicola的酰胺酶AM合成基因的基因片段。

                        關鍵詞:海洋放線菌;NdeI;EcoRI;酰胺酶;腈水解酶超家族

                         放線菌與人類的生產和生活息息相關,是很多天然藥物和生物活性物質的重要來源[1]。海洋放線菌產生了許多具有特殊化學結構,以及特殊生理活性和生理功能的物質[2]。盡管海洋放線菌的類群和數量都非?捎^,但很多研究者使用經典的分離培養方法培養卻失敗了 [3]。近年來,從海洋放線菌中陸續發現的SalinosporamideA等一系列新的活性化合物,均可證明海洋是一個具有極大地潛力的資源寶庫[4-7]。

                          因此,本研究旨在以稀有海洋放線菌Salinispora arenicola CNS-205為實驗材料,克隆出海洋放線菌酰胺酶AM的完整基因。,以為該基因簇的功能研究奠定基礎。

                          1 試驗材料與方法

                          1.1 試驗材料

                          1.1.1 菌種來源

                          海洋放線菌Salinispora CNS-205分子生物學實驗室保存為本實驗室保存。

                          1.1.2 主要試劑

                          大腸桿菌DH10B; 限制性內切酶NdeI和EcoRI;DNA分子標準量marker;DNA聚合酶。 DNA 提取試劑盒,T4DNA 連接酶,凝膠回收試劑盒,質粒小提試劑盒等,均購買自天根生化科技(北京)有限公司;其余均為國產分析純試劑。

                          1.2 試驗方法

                          1.2.1 重組質粒的構建

                          PCR反應體系:H2O 28.5 微升μL,5*FAST HiFidelity PCR Buffer 10 微升μL,20* FAST PCR Enhancer 2.5 微升μ L,DMSO 2 微升μL,Template 2 微升μL,PrimerL 2 微升μL,PrimerR 2 微升μL,FAST HiFidelity polymerase 1 微升μL。PCR程序:升溫90 ℃,2 min;DNA變性 95 ℃,30 s;退火53 ℃,30 s;引物延伸72 ℃,2 min;30周期后,72 ℃維持10 min,電泳。PCR產物的片段為雙鏈平末端,需通過酶切的方式將粘性末端黏性末端暴露出來。酶切反應體系如下(50 mL反應體系):

                          水 11 mL

                          EcoRI Buffer 5 mL

                          PCR回收樣品 30 mL

                          EcoRI 2 mL

                          NdeI 2 mL

                          然后放入37 ℃水浴鍋中水浴2小時 h,經膠回收后的PCR產物連入pUC-18載體。

                          酶連體系(20 mL反應體系):

                          滅菌水 6 mL

                          PCR樣品回收片段 10 mL

                          PpUC-18回收片段 1 mL

                          10*T4 DNA Ligase Buffer 2 mL

                          T4 DNA Ligase 1 mL

                          1.2.4 酶切驗證

                          用EcoRI和NdeI酶切,酶切反應體系如下(10 mL反應體系):

                          水 6.2 mL

                          EcoRI Buffer 1 mL

                          抽提的質粒樣品 2 mL

                          EcoRI 0.4 mL

                          NdeI 0.4 mL

                          2 試驗結果與分析

                          2.1 目的基因的PCR擴增

                          以海洋放線菌總DNA為模板, ,用上述引物進行擴增,再EcoRI 和NdeI 酶切回收。原PCR產物的目的條帶應位于大約1 800 bp處。,如圖1所示。

                          圖1 1 PCR電泳圖

                          2.2 重組質粒的驗證

                          圖2中第一個條帶約在約2 700 bp左右,為載體的酶切條帶;第二個條帶位于1 800 bp左右,為目的基因的酶切條帶。得出該重組質粒后,測序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。結果如下圖2所示:

                          圖2 2 酶切驗證圖

                          3 討論

                          酰胺酶的;D移活性能催化底物生成其相對應的異羥肟酸,異羥肟酸可作為食品添加劑、生長因子、抗白血病、抗肺結核病、腫瘤抑制因子等藥物,是極為重要的可用于化學治療的物質,具有重要的生物學活性。其金屬離子的螯合作用還可以為微生物所吸收利用,在金屬離子匱乏的環境中具有重要的意義 [8]。

                          參考文獻:

                          [1]W Fenical,PR Jensen. Developing a new resource for drug discovery: marine actinomycete bacteria[J].Nature Chemical Biology,2006,2(12):666-673.

                          [2]侯艷華.四株海洋放線菌遺傳轉化體系的研究[D].青島:中國科學院研究生院,2006.

                          [3]田 新,朋張偲,李文均.海洋放線菌研究進展[J].微生物學報,2011,51(2):161-169.

                          [4]馬艷玲.海洋放線菌基因組文庫的構建和功能基因的克隆及序列分析[D].武漢:華中師范大學,2011.

                          [5]B Bister,D Bischoff,M Ströbele,etal. Abyssomicin C-A polycyclic antibiotic from a marine Verrucosispora strain as an inhibitor of the paminobenzoic acid / tetrahydrofolate biosynthesis pathway[J].Angewandte Chemie International Edition,2004,43(19):2574-2576.

                          [6]HC Kwon,CA Kauffman,PR Jensen,etal. Marinomycins A-D, antitumor-antibiotics of a new structure class from a marine actinomycete of the recently discovered genus "Marinispora"[J].ChemInform,2006,128(24):16410.

                          [7]宋亞鵬.丙烯酰胺神經毒性機制研究進程[J].畜牧獸醫雜志,2010,29(2):43-45.

                          [8]韓嘉媛.丙烯酰胺的毒性研究[J].衛生研究,2006,35(4):513-515.

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